Olga Zeni

Olga Zeni

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Nonostante l’intensificarsi delle sperimentazioni in vivo e in vitro sulla valutazione degli effetti a lungo termine dei campi elettromagnetici abbia generato, negli ultimi decenni, una vastissima letteratura, ad oggi il dibattito scientifico è ancora aperto sui possibili meccanismi specifici di interazione a bassi livelli di campo responsabili di specifici effetti biologici. Ciò è principalmente dovuto alla notevole eterogeneità delle ricerche e alla scarsa riproducibilità delle stesse. Le sperimentazioni in vitro eseguite dai ricercatori dell’ IREA in condizioni controllate e quindi riproducibili rappresentano un valido strumento per la comprensione dei meccanismi di interazione e la verifica delle ipotesi di meccanismo ad oggi formulate. La comprensione dei meccanismi rappresenta un punto chiave sia nella definizione degli standard di sicurezza sia nello sviluppo di applicazioni mediche.        

  

La disponibilità di tecniche sensibili per la valutazione degli effetti a carico del DNA in linfociti umani è un punto cruciale al fine di valutare il ruolo delle esposizioni croniche a campi ELF nell’insorgenza di cancro e in particolare leucemia. Nel corso degli anni i ricercatori IREA hanno messo a punto tecniche di citogenetica classica e molecolare per la valutazione di danno sia cromosomico (test del micronucleo) sia diretto alla molecola di DNA (test della cometa) in linfociti umani da sangue periferico o isolati da buffy coat. 

analizzatore

Analizzatore di immagini per l'analisi di campioni cellulari ottenuti mediante il test della cometa

Evidenze sperimentali hanno mostrato l'efficacia degli impulsi elettrici ultracorti per il trasporto di geni o sostanze chimiche (gene and drug delivery) nella cellula, per la terapia del cancro, per l’induzione di apoptosi. Tali applicazioni sono conseguenza di una permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica e di quelle intracellulari, con effetti dipendenti sia dalla durata e dall'intensità degli impulsi sia dal tipo cellulare impiegato, anche se i meccanismi di azione secondo i quali tali impulsi sono in grado di interagire selettivamente con le strutture cellulari ed intracellulari necessitano di adeguati approfondimenti. In tale contesto, l’attività svolta presso l’IREA è indirizzata all’osservazione e comprensione dei meccanismi di permeabilizzazione della membrana plasmatica e degli effetti al livello del nucleo e degli organuli cellulari. Le tecniche utilizzate a tale scopo comprendono saggi di citofluorimetria e di citogenetica molecolare (Comet Assay) e misure real time tramite microscopia confocale.  

La possibilità di investigare gli effetti degli impulsi ultracorti a livello cellulare e subcellulare è strettamente connessa alla disponibilità di sistemi generatori di impulsi altamente controllati e flessibili, che consentano di variare entro ampi range le condizioni di esposizione (durata, ampiezza, frequenza degli impulsi). In quest’ambito, l’attività svolta presso l’IREA, in stretta collaborazione con il Dipartimento di Ingegneria dell’Informazione della Seconda Università di Napoli, riguarda il progetto e la realizzazione di network per la generazione di impulsi elettrici di ampiezza, durata e frequenza variabile. Tali sistemi vengono interfacciati con applicatori specifici che consentono di esporre colture cellulari in vitro, e di effettuare saggi biologici sia in real time, sia in tempi differiti rispetto all’esposizione stessa.

SISTEMA_ELFPer le esposizioni di colture cellulari vengono realizzati apparati espositivi che utilizzano sistemi di bobine circolari poste orizzontalmente e parallele alla superficie della coltura cellulare. La geometria del sistema di bobine viene calcolata numericamente per ottimizzare l’estensione dell’uniformità di campo magnetico. Ogni bobina è costituta da 2 avvolgimenti paralleli in modo tale che, in accordo con la differente alimentazione, la corrente possa fluire nella stessa direzione (configurazione avvolta) o nella direzione opposta (configurazione contro-avvolta). In questo ultimo caso i campi magnetici si annullano dando luogo ad un  sistema sham in cui la corrente e la potenza dissipata sono le stesse del sistema in configurazione avvolta ma il campo magnetico è nullo. I sistemi per le esposizioni e per le esposizioni sham vengono posti nello stesso incubatore per colture cellulari per il controllo dei parametri ambientali. In alcuni casi, per ridurre l’interferenza tra i due sistemi di esposizione viene posto un foglio di µ-metal per schermare il sistema sham dal campo prodotto dal sistema di esposizione.   

Distribuzione_campo_Petri2Il termine dosimetria si riferisce alla valutazione della quantità (dose) e della distribuzione di potenza elettromagnetica assorbita dal campione biologico in esame, quando siano note sia le caratteristiche del campo elettromagnetico incidente (frequenza, modulazione, polarizzazione) sia le condizioni di esposizione. Queste ultime comprendono le caratteristiche morfologiche ed elettromagnetiche (permittività dielettrica e conducibilità) del campione esposto e le proprietà dell’ambiente in cui avviene l’esposizione stessa. La grandezza dosimetrica fondamentale alle frequenze di microonde è il tasso di assorbimento specifico o SAR (Specific Absorption Rate, W/kg), dato dalla potenza elettromagnetica dissipata nel campione per unità di massa. La scelta del SAR come parametro dosimetrico di riferimento deriva dal suo uso nelle normative internazionali riguardanti la protezione dai campi elettromagnetici, e dal fatto che può essere utilizzato per confrontare effetti biologici osservati in diverse condizioni di esposizione.

I metodi e le tecniche di cui la dosimetria si avvale possono essere sia di natura sperimentale, sia di natura teorica e numerica.

In particolare, la dosimetria sperimentale utilizza specifici strumenti per misurare le grandezze dosimetriche direttamente nel campione esposto. Per la misura del SAR, ad esempio,  si utilizzano sensori di campo elettrico oppure sensori di tipo termico, essendo esso legato anche all’incremento di temperatura indotto dall’esposizione al campo. Quando non è possibile effettuare la misura direttamente nel campione esposto, come nel caso dei tessuti umani, vengono realizzati dei fantocci che rappresentino, il più fedelmente possibile, le proprietà morfologiche ed elettromagnetiche del corpo biologico, o di parti di esso.

La dosimetria teorica consiste nella risoluzione diretta di un sistema di equazioni di Maxwell, che descrive l’interazione tra il campo elettromagnetico ed il campione, nell’ambiente e nelle condizioni di interesse. L’utilizzo di codici di calcolo (dosimetria numerica) e degli elaboratori moderni ha molto migliorato le prestazioni di questo tipo di analisi, consentendo, da un lato, la rappresentazione  di modelli sempre più accurati e realistici dei sistemi esposti, e, dall’altro, la risoluzione veloce ed efficiente di problemi elettromagnetici complessi.

I sistemi di esposizione devono avere dimensioni idonee per essere ospitati in incubatori per colture cellulari, al fine di garantire nei campioni biologici le condizioni ottimali di temperatura, di anidride carbonica e di umidità. Essi devono operare in condizioni rigorosamente controllate in termini di temperatura e dosimetria del campione biologico al fine di garantire assenza di incremento termico nei campioni biologici durante l’esposizione, una buona uniformità di campo all’interno del campione e la conoscenza della dose effettivamente assorbita dal campione biologico (Specific Absorption Rate, SAR). Sistemi di esposizione uguali a quelli impiegati per le esposizioni, ma non alimentati, vengono utilizzati per alloggiare i campioni di controllo (campioni sham) al fine di escludere che gli effetti eventualmente riscontrati siano dovuti alle condizioni che si creano all’interno dei sistemi espositivi e non al campo elettromagnetico in essi generato.

Le esposizioni, di durata variabile sulla base del bersaglio biologico analizzato, vengono effettuate sia in onda continua (CW) sia modulata, a valori di SAR confrontabili con il valore soglia di 2 W/Kg stabilito dalla Commissione Internazionale per la Protezione dalle Radiazioni non Ionizzanti (ICNIRP), per esposizioni della popolazione in genere in questo range di frequenze. A valle delle esposizioni, i campioni cellulari vengono processati per la valutazione di endpoints quali la vitalità e il ciclo cellulare, la morte cellulare programmata o apoptosi, il danno al DNA e lo stato ossido-riduttivo cellulare, che hanno un ruolo chiave nel processo di cancerogenesi.

La rigorosità della sperimentazione biologica è una condizione essenziale ai fini del confronto con altre sperimentazioni, della replicazione della stessa e soprattutto della corretta interpretazione dei risultati ottenuti.

A tal fine i modelli cellulari vanno scelti opportunamente sulla base dei parametri biologici in esame, i saggi biologici vanno messi a punto nelle condizioni specifiche del laboratorio; inoltre nella sperimentazione devono essere inclusi trattamenti con agenti specifici che inducono alterazioni nei parametri in esame (controlli positivi)  per garantire che le cellule rispondono in maniera adeguata agli stimoli, e che i saggi biologici vengono applicati correttamente.   

nanoparticelle    
Internalizzazione di anticorpi marcati per il delivery selettivo
di nanoparticelle magnetiche in cellule A431
 

Secondo una stima dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, nel corso del 2008 si sono verificati circa 12 milioni di nuovi casi di cancro e circa 8 milioni di morti. Al momento, l’unico modo per curare questa patologia è la resezione radicale del tumore nei primissimi stadi di sviluppo. Spesso accade che le metastasi siano già presenti al momento della diagnosi, per cui solo pochi pazienti hanno l’opportunità di ricevere la resezione radicale e si rendono necessarie terapie quali chemio e radio.

Come è noto i chemioterapici colpiscono tutte le cellule in rapida divisione, incluse le cellule sane con conseguenze dannose per l'organismo in toto. Per questo motivo è fondamentale lo sviluppo di nuove metodologie diagnostiche e terapeutiche capaci di diagnosticare il cancro sin dai primissimi stadi di sviluppo e di veicolare selettivamente i chemioterapici nelle cellule tumorali senza alterare quelle normali.

Metodi emergenti per individuare e trattare il cancro si basano sull'uso congiunto di campi elettromagnetici e nanoparticelle. In questo contesto l’attività dei ricercatori dell’IREA, grazie alle competenze sia in ambito ingegneristico che biologico, si propone di studiare le interazioni tra campi elettromagnetici alle frequenze di microonde e nanoparticelle, al fine di proporre nuove strategie per aumentare sia la sensibilità dell’imaging a microonde sia la selettività della terapia termica a microonde.

Un aspetto essenziale dal quale non si può prescindere sin dall’inizio dello sviluppo di queste nuove strategie è la verifica dell’assenza di citotossicità delle nanoparticelle in esame. Questo ultimo aspetto viene affrontato valutando gli effetti citotossici in linee cellulari umane sia di tessuti sani che tumorali applicando metodiche sensibili e ben standardizzate.

ns setup

L’esposizione di cellule di mammifero a campi elettrici pulsati di sufficiente intensità e breve durata, è in grado di indurre un significativo aumento della permeabilità della membrana cellulare a sostanze (ioni, molecole) che normalmente non possono entrare all’interno della cellula (elettroporazione). In particolare, campi elettrici pulsati (pulsed electric field: PEF) di ampiezza fino ad alcuni kV/m e durate nel range dai millisecondi (ms) ai microsecondi (μs) vengono attualmente utilizzati per potenziare l’efficacia di farmaci chemioterapici (elettrochemioterapia) nel trattamento di tumori solidi superficiali, o anche per facilitare il processo di disattivazione microbica nel trattamento dei cibi e delle acque. Più di recente, grazie allo sviluppo di nuove tecnologie nell’ambito dell’elettronica di potenza, si è arrivati alla possibilità di generare PEF di intensità ancora maggiore (MV/m) e di ancor minore durata (nel range dei nanosecondi, ns). Si è visto che tali impulsi (nsPEF), quando applicati alle cellule, sono in grado non solo di permeabilizzare la membrana cellulare esterna, ma anche di interagire con le strutture intracellulari, e di indurre diversi pathway di morte cellulare in cellule tumorali. Tali osservazioni hanno suscitato l’interesse di molti gruppi di ricerca al livello internazionale, e lo studio dell’interazione tra tali tipi di impulsi e le strutture biologiche potrebbe portare alla definizione di una nuova tecnologia per la terapia del cancro, di tipo non termico e che non richiede l’uso di farmaci. In questo contesto, l’attività dei ricercatori IREA è tesa alla caratterizzazione degli effetti dell’esposizione a PEFs in colture cellulari di mammifero, con particolare attenzione allo studio dei meccanismi di interazione ad oggi solo marginalmente noti. Inoltre, in collaborazione con il Dipartimento di Ingegneria dell’Informazione della Seconda Università di Napoli, vengono progettati e realizzati sistemi innovativi per la generazione di impulsi e per la loro applicazione ai campioni cellulari.  

cellulareA causa dell’aumento esponenziale dell’uso dei telefoni cellulari, la ricerca degli ultimi anni è centrata sulla valutazione degli effetti di esposizioni alle frequenze ad essi associate (800-2000 MHz).

Esistono dunque rischi per la salute da esposizione alle radiazioni emesse dai telefoni cellulari? Nonostante il grande lavoro di ricerca teso a individuare l’eventuale rischio cancerogeno dovuto all’esposizione ai campi elettromagnetici in uso per la telefonia cellulare, non si è giunti ad una conclusione univoca. Nel 2011 l'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha classificato i campi elettromagnetici a radiofrequenza come possibilmente cancerogeni per gli esseri umani indicando, al contempo, la necessità di continuare a monitorare attentamente l'associazione fra l'uso dei telefoni cellulari e il rischio di tumore conducendo ulteriori ricerche a lungo termine.

Presso il laboratorio di bioelettromagnetismo dell’IREA l’attenzione è rivolta ai segnali di seconda (GSM) e terza (UMTS) generazione, al fine di valutarne gli effetti in colture di linfociti umani e linee cellulari stabilizzate. Tra i modelli cellulari, le cellule nervose hanno un ruolo chiave a causa della vicinanza del telefono cellulare alla testa dell’utilizzatore. Vengono impiegati sistemi di esposizione quali guide d’onda, celle TEM e wire patch cells, opportunamente disegnati e realizzati in accordo con gli standard di qualità dell’Organizzazione Mondiale della Sanità per esposizioni in vitro, al fine di adottare condizioni di esposizione ben definite. I risultati a tutt’oggi ottenuti non riportano alterazioni di parametri critici della funzionalità cellulare mentre sono state accumulate evidenze che esposizioni a campi a radiofrequenza sono in grado di ridurre i danni provocati al DNA da agenti mutageni .

Nell’ambito delle alte frequenze, la sperimentazione alle frequenze dei THz è di grande attualità considerando le recenti tecnologie e applicazioni che utilizzano tali frequenze soprattutto in ambito biomedico. In questo ambito l’IREA è stato coinvolto nel progetto “THz radiation in Biological Research: Investigation on Diagnostics and study of possible Genetic Effects (THz-BRIDGE)”, finanziato dalla Comunità Europea nell’ambito del V Programma Quadro, per valutare l’induzione di danno al DNA in linfociti umani da sangue periferico. La sperimentazione è stata svolta in collaborazione con l’ENEA di Frascati, dove è disponibile un laser ad elettroni liberi (FEL) che genera una radiazione coerente nel range di frequenza 90-150 GHz.

 

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